细胞转染常见问题
——百恩维转染试剂

1、你们转染试剂的转染范围是那些？
答：Polyfectine转染试剂是百恩维生物公司（Biowit Technologies）最新研发合成的新型纳米聚合物高效转染试剂，既可以感染分裂细胞也可以感染非分裂细胞。可用于In vivo动物体内的转染，更可以用于悬浮培养细胞（如293-F、CHO-S等）的高效转染。
HET是百恩维开发专用于病毒包装的转染试剂，UES专用于电转染。

2、你们转染试剂的稳定性如何？
答：百恩维的转染试剂一般通过常温运输，并在4 °C下保存。在正确地存储和使用的前提下，百恩维保证产品自购买之日起六个月内性能完好。

3、我在哪里看到你们的说明书和报价？
答：您可以登录百恩维官方网站：http://www.biowit.com.cn/。可在产品界面页面下载说明书。

4、百恩维转染试剂可使用次数是多少？
答：转染试剂的使用次数取决于细胞种类以及需要转染的物种。就293F细胞而言，1ml的Polyfectine可用于125次6孔板转染；2500次96孔板转染，每孔转染成本不足0.5元。是目前市面上性价比最高的主流转染试剂。

5、细胞代数和融合度对转染效果有影响吗？
答：传代次数可能影响转染实验。 我们建议在细胞分瓶和铺板实验操作时要保持一致性。 传代次数过多可能会降低转染效率。 如果转染效率开始降低，并且所用细胞已培养很长时间、传代过多、或有过不适当的传代操作，我们建议复苏于液氮中保存的细胞重新开始培养。 整体而言，融合度越高，对于转染效果越好。转染细胞的融合度要求保持90%~95%，此时Polyfectine的转染效率保持最高水平。

6、转染时是否可以使用含血清培养基？
答：使用百恩维转染试剂进行转染时，有无血清并无影响。

7、转染时培养基可以加入抗生素吗？
答：我们实验证实，转染时培养基添加了青霉素和链霉素，对转染效果会有一定影响。毕竟转染时使用抗生素可能会增加细胞死亡率。为了保证最佳转染效果，建议转染时不要加入抗生素。对于稳定转染，也要在转染后至少 72 小时再加入筛选用抗生素。

8、百恩维的转染试剂可以转染那些类型的因子？
答：DNA、RNA、SiRNA。转染的 DNA 可以是质粒、粘粒。

9、百恩维的转染试剂可用于共转染质粒吗？ 我可以共转染质粒和 siRNA 吗？
答：可用于共转染质粒，共转染质粒和 siRNA是完全可行的。

10、对于 RNAi 应用，百恩维推荐何种转染试剂？
答：最佳选择无疑是Polyfectine！

11、我使用的孔尺寸与方案中的要求不同， 我该如何放大或缩小转染反应？
答：我们的每种转染试剂的说明书均附有孔尺寸表，您可以根据孔面积大小以及使用DNA的量，转染细胞种类放大或缩小。

12、我是否可以对不同的细胞系使用相同量的转染试剂？
答：请参考转染试剂随附的产品信息来进行实验优化。在大多数情况下，产品随附的转染方案提供了每孔所用转染试剂量的最佳范围。 这个转染试剂使用量范围在产品研发过程中已证明适用于多种细胞系。 如果对某种细胞系仍然没有达到理想的效果，可能需要进行进一步优化。 如果需要更多帮助以优化方案，请联系技术支持部info@biowit.com。

13、为什么我的转染效率较低？
答：优化条件：对大多数质粒或DNA/RNA片段，我们推荐的质粒或DNA/RNA片段与Polyfectine的质量比优化条件是1：2－3, 但这是一般情况，质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种特殊情况需要对质粒转染试剂的配比进行优化。
抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。
细胞状态及融合度：长势旺盛的细胞转染效果更佳，细胞密度应该在转染时融合度至少70%以上。
DNA纯度及数量：确保质粒OD值A260/A280 在1.8~2.0之间。DNA量不能太高，单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。

14、对于成纤维细胞和干细胞你们有何建议？
答：成纤维细胞用电转染效果更佳，我们有相应的电转染试剂UES。该试剂可支持成纤维细胞50%以上的电转染效率。干细胞是目前最常用病毒介导方法，百恩维提供病毒多种现成病毒，也可以提供个性化的病毒包装服务。

15、可以转染悬浮细胞吗？
答：Polyfectine转染悬浮细胞效果非常好。

16、百恩维转染试剂得到更高的蛋白表达？
答：绝对是的！转染，自然就希望得到更好的表达。Polyfectine 更优于其他转染试剂，特别在于它能令细胞表达水平更高，表达时间更长！特别是在HeLa, NIH/3T3, COS-1, COS-7, CHO-K1, CHO-S, Hep G2, HEK-293, MCF-7,昆虫细胞株High Five，Sf9等细胞中表达量显著提高。

17、转染试剂应用范围如何？
答：那更好啦！Polyfectine不含动物来源成分，令实验适用范围更广，在特殊实验需要时你也不必另外购买不含动物来源成分的转染试剂，一支搞定。Polyfectine成分相当稳定，对付各种细胞、各种转染规模，操作步骤都一样简单固定，不用去血清或者更换培养基，省时省事。

18、Polyfectine能用于动物体内转染吗？
答：是的！Polyfectine能有效的进行体内转染。同时也是基因治疗的理想非病毒载体，适用于将基因运送到不同的组织中。

19、需要对转染试剂进行优化，转染的起始指标是？
答：如果您希望取得最佳的转染效果，百恩维极力建议优化Polyfectine试剂的转染因素，最先，实验改变转染DNA的量（0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 μg DNA每孔/24孔板），质量比为DNA：Polyfectine为2：1。在一个24孔板中测试各种DNA的浓度（每一个DNA浓度重复3次），一旦确定最佳DNA的浓度，可进一步改变质量比（1:1.5-1:4）

20、在第一次使用Polyfectine试剂转染一个特定的细胞株时，需对哪些因素作优化？    

答： 当首次使用Polyfectine试剂时，可对3个主要的因素做优化（以24孔培养版为例）：DNA与试剂的质量（N/P）比，一般为1:1.5-1:4。所用DNA的量,一般为0.5-1μg，酚/氯仿方法提取的DNA可能需要2μg，细胞接触试剂-DNA混合物的时间，一般为24-72小时。

病毒包装及使用的常见问题

1、问：关于病毒载体种类的选择的问题。从载体的毒性对实验的影响来说，是逆转录还是腺病毒好呢，还是其他病毒好？从操作的难度可行性来说是病毒要比腺病毒容易很多吗？
答：操作难度上病毒与腺病毒都差不多,是指重组病毒的制备和纯化角度来说的，AAV的制备就更复杂更难一些。
从载体毒性而言，病毒毒性较大，但它相对较少引起受体的免疫原性，而腺病毒则有较大的免疫原性。腺相关病毒载体是比较理想的基因治疗载体，免疫原性较低，而且对受体伤害较少。
从插入目的基因角度考虑，病毒最大插入基因长度是5k，腺病毒最大插入基因长度是8k，腺相关病毒最大插入长度是3k。
对大多数研究者来说病毒仅仅是一个基因转移工具，在自己的研究工作中只代表工作量，并没有值得大写特写的地方。因此，把这样的工作委托出去，就象把测序、合成引物等工作交给别人做一样。
即便是委托出去，也要明白自己的实验目的和要求是什么，才能很好地选择，同时尽量节省经费。以腺病毒载体为例，可以这样选择：买穿梭质粒，自己做构建、鉴定和大提，交给公司做出毒、扩增和纯化和检测。根据自己的实验要求，可以选择精纯化，也可以选择粗纯化；条件好的可以选择自己做一部分检测。
至于你的实验是选择腺病毒好，还是病毒或别的病毒载体好，主要还看你的实验目的，其次才是看那种病毒载体容易做。

2、问：重组病毒产品如何运输和保存？
答：病毒产品一般采取干冰运输。腺病毒及腺相关病毒也可以采用冰袋运输。
避免重组病毒反复冻融，请酌情分装后于-80℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。在我们提供的保存液中，病毒产品-80℃保存期为半年。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时，4℃可保存1~2周。但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。

3、问：用于体内试验的重组病毒，是否要求纯化？
答：是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的病毒外壳和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。

4、问：病毒载体可以浓缩或稀释吗？方法如何？
答：可以浓缩：对于一般实验室用户，可以采用高速离心办法浓缩。目前市面上的病毒浓缩纯化办法很多，有不少商业化产品。不同的病毒纯化办法不同。腺病毒载体可以用300K以下的浓缩离心管（PALL 公司产品）进行浓缩。一般来说浓缩后的滴度以不超过3×1012v.p/ml为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完。
 
5、问：小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？体内表达时间和表达高峰如何？
答：大部分文献显示，腺病毒用量范围在108-10IU/只小鼠。根据我们的经验，小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。

6、问：腺病毒载体对小鼠的半致死剂量（LD50）大概是多少？
答：据我们的经验，静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50未测到：1×1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡。

7、问：VP，PFU，IFU 的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？
答：VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性） 和 “死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。
PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的 “活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。
IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。
VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。

8、问：感染细胞最佳MOI的测定？
答：MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞，比如HeLa、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。

9、如何保证病毒包装实验室安全？
答：病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！
所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，不要使用培养板来感染病毒，以防意外洒落。对共用实验室的人员进行病毒安全培训或提示。

10、慢病毒滴度检验办法
答：常用的有核心蛋白定量法、RNA基因组定量法、DNA基因组定量法、流式细胞计数法、生物学滴度法、抗性克隆筛选法。

11、关于病毒载体安全性问题
问：病毒载体安全性有些问题，你对此是怎么看待，如何解决？比如：免疫原性问题
答：病毒载体的安全性是业界一直关系的问题。尽管病毒载体都删去了致病基因，但病毒在包装过程中会发生基因重组，存在致病风险性。该问题需要更多的实验进行验证。
病毒载体的免疫原性各不相同。关键在于如何使用载体，应针对不同疾病选用不同载体。
比如腺病毒载体的免疫原性很强，一般用于治疗肿瘤和用做疫苗载体。这时其免疫原性并不是什么缺点，反而还有好处，起到免疫佐剂的作用。
反转录病毒载体和AAV病毒载体的免疫原性很弱，用于需要长期表达和忌讳引起免疫反应的情况，比如自身免疫性疾病。

12、病毒载体的开发和利用问题
问：病毒载体靶向性强，且能稳定的在体内表达，现被认为最有开发价值的转导系统，但是安全性受到质疑，载体本身也受到一定的限制。如何开发和利用病毒载体？
    答：病毒载体是一个工具，一般的研究者的主要精力应该用在挖金矿上，而不是制造工具上。目前国内也存在专门研究不同病毒载体的机构，专门为研究者制备载体。
对于专门研究载体的研究者而言，载体的靶向性、容量和安全性都是热点。
靶向性研究的热点主要也集中在这两方面：
①对病毒的外壳蛋白基因进行改造，主要是在基因的某些位点插入特定短肽。依靠这些短肽来改变对细胞的亲嗜性。
②用不同血清型的病毒做载体。如AAV有9种不同的血清型。

13、腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中？如果不是，那么整合率大概有多少？ 是不是跟靶细胞类型有关呢？
答：野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的．
AAV载体是经过改造的，已经去除了其repcap基因，因此已经失去了特异整合的特性。
对于不同的靶细胞，AAV载体的整合几率是不同的。越来越多的研究发现，在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合，而以附加子（episome）形式存在，最为典型的是在肌肉中。
也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的，有整合到活跃的基因中的倾向。

14、病毒载体对目的基因的长度是否有要求？
答：有AAV的总包装容量是4.7 kb，载体中ITRs（两个ITR共290 bp）+hCMV（约750 bp）+polyA（约150 bp）约1200bp，所以如果用AAV包装载体，目的基因长度要求不超过3.5 kb。
相对应慢病毒目的基因长度不超过5kb，腺病毒载体目的基因长度要求不超过8kb。

15、我的试验需要多少总量的AAV载体？
答：AAV介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分。根据我们的经验需要AAV的病毒量总量约为5×1012v.g.（一般AAV动物实验低、中、高剂量组用药量分别为1011、1012、1013v.g./kg左右）。

16、据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达，为什么？
答：AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。这是因为AAV基因组是单链的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。此外，AAV对细胞毒性低，培养的细胞在加入AAV后，细胞分裂生长能力不受太大的影响，这样也对AAV载体有一种稀释作用，也导致其表观表达水平较低。而在体内应用时，注射部位的组织细胞通常没有显著增殖，不会出现AAV载体被稀释的情况，而且在体内各种促进AAV载体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富，故体内应用时，AAV载体的表达水平比较高。
研究表明辅助病毒或其它辅助因子可以明显促进单链DNA复制成双链DNA，从而明显提高外源基因的表达水平，故在体外应用可以考虑加入辅助病毒（Ad5）或丁酸钠（终浓度10~50mmol/L），这样可以提高表达水平达5~10倍。

17、如何才能用重组病毒载体在细胞上做出满意的结果？
答：病毒载体在细胞试验中要想取得满意的结果，主要在以下几个方面：
①病毒载体在不同的细胞由于细胞表面受体的差异而不同转导效率不同，尽量选择转导效率高的细胞，可用参考文献报道和转导报告基因进行筛选。
②良好的细胞状态。
③最好在细胞状态最佳时感染病毒。特别是不要在消化细胞后不久就感染，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏，应该培养过夜后再感染病毒，效果较好。
④适当的转导MOI（病毒基因组数/细胞的比），一般可用105上下做倍比稀释。
⑤适当的转导体积，如24孔板可用200ul，6孔板0.5ml。
⑥转导时间为1-2h，每25分钟晃动培养板混匀一次。（转导时，最好换用无血清培养基，因为血清对病毒的感染有些许不利影响）
⑦可加合适辅助药物刺激，增强表达。
⑧适当表达检测时间，如是分泌蛋白可每24h连续取培养上清检测。通常蛋白表达量在几百纳克至几微克/ml水平。

18、如何才能用病毒载体在动物体内做出满意的结果？
答：病毒载体在动物试验中要想取得满意的结果，主要注意以下几个方面：
①选择适当的血清型：例如不同的AAV血清型在动物体内同一组织有不同的转导效率，如AAV1在肌肉组织中、AAV5在肺组织中有很高的转导效率。
②选择适当的靶器官：同一血清型AAV在不同的组织具有不同的转导效率，尽量选择转导效率高的靶器官。
③转导途径：尽量选择局部直接多点注射靶器官。
④转导病毒量：根据我们的经验，所加病毒量太多表达量反而会降低。
⑤检测时间：根据我们的经验不同基因的表达高峰时间是不同的，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上的时间。

19、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？
答：腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右.

20、如果我的实验中需要将重组腺病毒注射入动物体内，如果贵公司提供的纯化产品比较浓，需要如何稀释病毒产品，有特殊要求吗？
答：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在没有保护剂的情况下，腺病毒在2～8℃保存时间越短越好。

1. AAV病毒载体对目的基因的长度是否有要求？
 答：有，AAV的总包装容量是4.7 kb，载体中ITRs（两个ITR共290 bp）+hCMV（约750 bp）+polyA（约150 bp）约1200bp，所以如果用AAV包装载体，目的基因长度要求不超过3.5 kb。

2. 腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中？如果不是，那么整合率大概有多少？是不是跟靶细胞类型有关呢？
 答：野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的． AAV载体是经过改造的，已经去除了其repcap基因，因此已经失去了特异整合的特性。对于不同的靶细胞，AAV载体的整合几率是不同的。越来越多的研究发现，在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合，而以附加子（episome）形式存在，最为典型的是在肌肉中。
 也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的，有整合到活跃的基因中的倾向。

3. 我的试验需要多少总量的AAV载体？
答：AAV介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分。
百恩维生物制备和提供的rAAV病毒而言，通常AAV病毒颗粒数与受试细胞数的比例大于104 vg/cell才能检测到外源基因的表达，达到105~106 vg/cell才能获得较理想的表达水平。然而，也不是比例越高越好，当比例大于107时，外源基因的表达水平反而会明显下降，甚至几乎检测不到表达。其机理尚不清楚，这可能与AAV病毒具有多个细胞受体有关，比如已知道AAV2病毒就有3个细胞受体。
根据我们的经验,一般AAV动物实验低、中、高剂量组用药量分别为1011、1012、1013v.g./kg左右。

4. 据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达，为什么？
 答：AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。这是因为AAV基因组是单链的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。此外，AAV对细胞毒性低，培养的细胞在加入AAV后，细胞分裂生长能力不受太大的影响，这样也对AAV载体有一种稀释作用，也导致其表观表达水平较低。而在体内应用时，注射部位的组织细胞通常没有显著增殖，不会出现AAV载体被稀释的情况，而且在体内各种促进AAV载体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富，故体内应用时，AAV载体的表达水平比较高。

5. 如何才能用AAV病毒在动物体内做出满意的结果？
答：病毒载体在动物试验中要想取得满意的结果，主要注意以下几个方面： ①选择适当的血清型：例如不同的AAV血清型在动物体内同一组织有不同的转导效率，如AAV1在肌肉组织中、AAV5在肺组织中有很高的转导效率。 ②选择适当的靶器官：同一血清型AAV在不同的组织具有不同的转导效率，尽量选择转导效率高的靶器官。 ③转导途径：尽量选择局部直接多点注射靶器官。 ④转导病毒量：根据我们的经验，所加病毒量太多表达量反而会降低。
⑤检测时间：根据我们的经验不同基因的表达高峰时间是不同的，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上的时间。

6. 如果我的实验中需要将AAV注射入动物体内，如果贵公司提供的纯化产品比较浓，需要如何稀释病毒产品，有特殊要求吗？
答：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在没有保护剂的情况下，AAV在2～8℃保存时间越短越好。